OLIGONUCLEOTIDE LÀ GÌ
Các chuỗi oligonucleotide có thể được hình thành bằng enzym thông qua phân lớp các phân tử sinh học lớn hơn hoặc thông qua quá trình tổng hợp hóa học có chủ đích. Trong trường hợp hình thành thông qua quá trình tổng hợp hóa học có chủ đích, tổng hợp organonucleotide là quá trình hóa học trong đó tổng hợp các nucleoside phosphoramidite – một yếu tố đơn phân quan trọng của các chuỗi oligonucleotide. Bản thân các nucleoside phosphoramidite (còn được gọi là nucleoside hoặc amidite) là các dẫn xuất của nucleoside tự nhiên hoặc tổng hợp.
Bạn đang xem: Oligonucleotide là gì
Do đó, nucleotide là các phân tử hợp chất gồm nucleoside liên kết cộng hóa trị và một nhóm photphat. Các nucleotide được liên kết theo một trình tự cụ thể để tạo thành sản phẩm mong muốn. Do đó, các chuỗi oligonucleotide gồm các đoạn ngắn của axit nucleic được liên kết với nhau tạo thành các polyme sinh học chuỗi đơn (“-me”). Vì hầu hết các chuỗi oligonucleotide (oligos) thường có đến 20 nucleotide liên kết (mặc dù có thể nhiều hơn), chúng có thể được coi là các phân tử sinh dược phẩm nhỏ.possible), they can be thought of as small biopharmaceutical molecules.
Giống như các phân tử nhỏ liên quan đến dược phẩm khác, quá trình tổng hợp oligonucleotide yêu cầu phải kiểm soát cẩn thận nhiệt độ, pH, chất lượng của cơ chất, v.v. Do các phương pháp điển hình được sử dụng trong quá trình tổng hợp oligonucleotide, nên trình tự nucleotide càng dài và càng phức tạp thì càng khó đáp ứng các mục tiêu về sản lượng, độ tinh khiết và chi phí. Công nghệ phân tích quy trình (PAT) là công cụ hữu ích giúp đạt được những mục tiêu này.
Các Chuỗi Oligonucleotide Là Gì?
Tạo Ra Phân Tử Sinh Học Cho Các Ứng Dụng Công Nghệ Sinh Học, Y Tế, Pháp Y và Lâm Sàng
Các chuỗi oligonucleotide, hoặc oligos, là các đoạn mạch ngắn đơn hoặc kép của axit nucleic được liên kết với nhau để tạo thành các polyme sinh học chuỗi đơn. Các bazơ nucleotide riêng lẻ có thể được coi là tương đương với các đơn phân tạo nên các polyme hóa học cổ điển. Một nucleotide gồm 3 phần: một bazơ chứa nitơ, một phân tử đường có năm nguyên tử cacbon (2 phần này là nucleoside), và một hoặc nhiều nhóm photphat. Ngoài ra, nucleotide có thể bao gồm các bazơ không tự nhiên hoặc không hợp quy. Ví dụ phổ biến: LNA (axit nucleic bị khóa), Morpholino và các bazơ hoặc xương sống đã biến đổi cấu trúc.
Sự liên kết phức tạp của các nucleotide tạo thành các phân tử sinh học RNA và DNA quan trọng về mặt sinh học. Trong trường hợp RNA, là một polyme sinh học mạch đơn, đường là ribose. Trong DNA thì phân tử mạch đôi này chứa đường deoxyribose. Chính các chuỗi ngắn của axit deoxyriobonucleic và axit ribonucleic là những khối cấu tạo nên các chuỗi oligonucleotide quan trọng. Các liên kết cụ thể của các nucleotide này tạo ra các phân tử sinh học đích được sử dụng trong các ứng dụng sinh học, y tế, pháp y và lâm sàng.
Các Chuỗi Oligonucleotide Được Sử Dụng Như Thế Nào?
Ứng Dụng Nghiên Cứu, Chẩn Đoán, Pháp Y Và Trị Liệu
Đoạn Mồi Và Đầu Dò Oligonucleotide
Công dụng phổ biến nhất của oligonucleotide tổng hợp là làm đầu dò và đoạn mồi tương đối ngắn (lên đến 30-mer) trong nhiều ứng dụng khác nhau. Việc này bao gồm quá trình tổng hợp trình tự nucleotide được bắt cặp hoặc “bổ sung ngược” thành mạch DNA đích hoặc RNA lớn hơn (trình tự đích). Ở vai trò đoạn mồi, oligo thường được sử dụng để bắt đầu các phản ứng enzym, chẳng hạn như để tạo ra hàng triệu đến hàng tỷ bản sao trình tự đích ngắn hoặc dài. Ví dụ phổ biến: phản ứng chuỗi polymerase (PCR) hoặc phương pháp giải trình tự Sanger. Các ứng dụng của đoạn mồi oligo bao gồm giải trình tự DNA, biểu hiện gen, nhân bản và chẩn đoán phân tử.
Ở vai trò đầu dò, oligo dùng để xác định và liên kết với một trình tự đích DNA hoặc RNA cụ thể để xác nhận sự hiện diện của trình tự này trong một vật liệu nhất định. Các ứng dụng sử dụng đầu dò oligo bao gồm các quy trình blotting như northern blotting (đối với RNA) hoặc southern blotting (đối với DNA), như các trình tự liên kết fluorophore trong microarray phát hiện những thay đổi về biểu hiện gen hoặc được sử dụng để sàng lọc các bệnh di truyền hoặc xác định các mầm bệnh cụ thể (chẩn đoán phân tử).
Trị Liệu/Liệu Pháp Gen Oligo
Trong các ứng dụng trị liệu, các chuỗi oligonucleotide antisense (ASO), thường là các loại từ 20 đến 30-mer, tận dụng lợi thế của sinh học tự nhiên và tạo điều kiện cho việc ức chế gen hoặc làm im lặng gen (phá hủy) các trình tự RNA không mong muốn hoặc hoạt động quá mức, việc này sẽ ngăn chặn sự biểu hiện của một số protein bị hư hỏng hoặc hoạt động quá mức có thể gây ra bệnh tật hoặc tạo điều kiện cho bệnh tật phát triển. Nghiên cứu về các phương pháp trị liệu dựa trên oligonucleotide đã gia tăng đáng kể và một số loại thuốc đã được phê duyệt trong những năm gần đây.
Ứng Dụng Nucleotide Tổng Hợp Trong Tương Lai: Khám Phá Các Phương Thức Vắc Xin DNA Và RNA
Mặc dù không phải là oligonucleotide theo định nghĩa nghiêm ngặt, nhưng các sản phẩm vắc xin dựa trên DNA hoặc RNA, chẳng hạn như mRNA hoặc plasmid hoặc axit nucleic dựa trên vector, có chiều dài hàng trăm hoặc hàng nghìn bazơ, là tiền đề của công nghệ nucleotide tổng hợp đang ngày một lớn mạnh.
Về khái niệm, vắc xin DNA hoặc RNA sẽ phòng được tất cả các phần không cần thiết hoặc có hại của vi khuẩn hoặc vi rút gây bệnh. Thay vào đó, loại vắc xin dựa trên axit nucleic như vậy sẽ chỉ chứa mã cho một vài phần DNA hoặc RNA của mầm bệnh. Các mạch DNA hoặc RNA này chỉ đạo cơ thể của chính bệnh nhân sản xuất các kháng nguyên riêng lẻ hoặc các đoạn của mầm bệnh, và sau đó thúc đẩy phản ứng miễn dịch đối với kháng nguyên. Với công nghệ tính toán hiện đại và trong mô hình silico, người ta có thể tạo ra các phương thức vắc xin oligonucleotide này trong vài ngày hoặc vài tuần khi có một trình tự đích thích hợp để thiết kế phòng chống. Trong vai trò công nghệ nền tảng, vắc xin gốc axit nucleic dựa trên các bộ tiêu chuẩn khối xây dựng hoặc nguyên liệu thô có thể tạo ra vô số sự kết hợp gần như theo ý muốn. Do đó, chúng cũng tương đối rẻ và dễ sản xuất so với các phương thức vắc xin truyền thống. Tuy nhiên, đây vẫn là một mô thức đang hoàn thiện cho ngành công nghiệp dược phẩm sinh học và những thách thức mới vẫn liên tục được nghiên cứu giải quyết, một số thách thức chỉ xuất hiện trong oligo và các sản phẩm axit nucleic dài và một số khác lại tương đồng với các phương thức trị liệu sinh học khác
Tổng hợp oligonucleotide là quá trình hóa học trong đó các nucleotide được liên kết đặc biệt để tạo thành sản phẩm có trình tự mong muốn. Tổng hợp pha rắn liên tục bằng tháp đã nạp thường được sử dụng để sản xuất các chuỗi oligonucleotide. Trong một số trường hợp thì phản ứng theo mẻ, huyền phù lại được sử dụng.
Quá trình sản xuất trình tự oligomer đích cần một số chu kỳ bao gồm các bước tổng hợp cụ thể. Trong bước đầu tiên, nhóm bảo vệ 4,4’ dimethoxytrityl trên nucleotide được hỗ trợ pha rắn bị loại bỏ. Tiếp theo, một monome phosphoroamidite được kích hoạt và nhanh chóng liên kết với nhau thông qua nhóm hydroxyl tự do trên nucleotide liên kết pha rắn để tạo ra một dinucleoside có chứa liên kết phosphite triester. Trong bước thứ ba, phosphite triester bị oxy hóa. Trong bước cuối cùng (của chu kỳ đầu tiên), bất kỳ nucleoside nào được hỗ trợ chưa phản ứng đều được “hạn chế” thông qua quá trình acetyl hóa để ngăn chặn hình thành các sản phẩm phụ không mong muốn trong chu kỳ tiếp theo.
Chiều dài của oligonucleotide được xác định bởi số lượng nucleotide tạo nên trình tự. Về mặt danh pháp, một trình tự dài 20 nucleotide được định nghĩa là “20-mer”. Chiều dài oligo có vai trò rất quan trọng đối với các ứng dụng khác nhau. Ví dụ, các oligo mer ngắn thường được sử dụng trong PCR, trong khi các chuỗi rất dài (200 bazơ trở lên) được sử dụng trong các ứng dụng đòi hỏi khắt khe như nhân bản hoặc chỉnh sửa CRISPR. Việc tổng hợp các oligo mer dài, chuyên biệt là một thách thức và việc tạo ra được một trình tự thuần khiết đòi hỏi phải có phương pháp kiểm soát tổng hợp và tinh chế hiệu quả. Trung bình, hầu hết các oligo có chiều dài nhỏ hơn 60-mer. Vì cách thức tổng hợp oligo đòi hỏi các chu kỳ phản ứng lặp đi lặp lại để thêm các nucleotide bổ sung, nên trình tự yêu cầu càng dài thì khả năng hình thành các sản phẩm phụ không mong muốn càng lớn – có thể bao gồm các trình tự xóa hoặc cắt xén.
Tùy thuộc theo mục tiêu chất lượng, số lượng và chi phí mà các phương pháp tinh chế khác nhau được sử dụng. Ví dụ, các oligo không chứa muối sẽ được loại bỏ các sản phẩm phụ của quá trình tổng hợp hóa học, nhưng các lỗi trình tự vẫn còn. Trên góc độ chi phí và hiệu quả, các oligo đã được khử muối này rất hữu ích từ cho các ứng dụng thông thường, chẳng hạn như PCR. Đối với các ứng dụng đòi hỏi khắt khe hơn, sắc ký pha ngược loại bỏ các trình tự không mong muốn khỏi sản phẩm, nhưng không hiệu quả bằng điện di gel – quy trình này cho ra sản phẩm trình tự có độ tinh khiết cao, nhưng thường ở số lượng hạn chế. Đặc biệt đối với các vấn đề lâm sàng, việc duy trì hiệu suất là mối quan tâm luôn hiện hữu trong suốt quá trình tổng hợp cũng như quy trình thu hồi và tinh lọc.
Tổng hợp hóa học pha rắn cổ điển thường bao gồm việc sử dụng polyme hoặc các hạt thủy tinh chuyên dụng không bị ảnh hưởng bởi các điều kiện phản ứng. Các hạt này có thể đựng trong các tháp mà các chất phản ứng, thuốc thử và dung môi chảy qua. Mục đích của các hạt là làm một nền tảng mà trên đó các phân tử cơ chất được liên kết cộng hóa trị, và sau đó hoạt động bằng phản ứng hóa học. Việc bảo vệ và khử bảo vệ một số nhóm chức năng trên phân tử cơ chất là yếu tố then chốt cho quá trình tổng hợp và để đảm bảo thu được sản phẩm mong muốn. Sản phẩm tổng hợp được loại bỏ bằng cách phá vỡ liên kết về mặt hóa học giữa sản phẩm và hạt polyme cơ sở.
Tổng hợp pha rắn có hiệu quả thu được sản phẩm tinh khiết nhanh, vì các tạp chất và vật liệu không phản ứng được rửa trôi trong các bước khác nhau của quá trình tổng hợp. Hơn nữa, toàn bộ quá trình tổng hợp có thể điều khiển bằng máy tính và tự động hóa. Tổng hợp pha rắn là phương pháp phổ biến nhất được sử dụng để sản xuất peptide và oligonucleotide tùy chỉnh. Trong trường hợp sản xuất oligonucleotide tùy chỉnh, cần nhiều chu kỳ lặp lại để thêm nucleotide liên tiếp để tạo thành trình tự đích.
Xem thêm: Cktg 2021: Dự Đoán Chung Kết Thế Giới Mùa 3 Lmht Mới Nhất, Dự Đoán Chung Kết Thế Giới Mùa 3 Lmht
Quá trình tổng hợp oligonucleotide pha rắn gặp nhiều thách thức, như hiệu suất suy giảm khi chiều dài chuỗi tăng lên. Sự cản trở của steric thường được chuyên gia giả thuyết là cơ chế hiệu suất kém trong đó một hoặc nhiều mạch cố định bề mặt có thể gây trở ngại cho mỗi lần kéo dài liên tiếp của mạch liền kề.
Để giải quyết các thách thức này cũng như các thách thức khác thì có nhiều phương pháp tổng hợp oligonucleotide pha lỏng.
Nhiều bước cơ bản của tổng hợp pha lỏng sẽ tương tự như tổng hợp pha rắn. Điểm khác biệt cơ bản là quá trình tổng hợp xảy ra trong dung dịch hoặc pha lỏng (tức là KHÔNG cố định trên bất kỳ bề mặt nào). Vì quá trình này vẫn tiến hành theo chu kỳ, nên có một số phương pháp kèm theo để loại bỏ các thuốc thử không phản ứng trong khi vẫn giữ lại sản phẩm oligonucleotide kéo dài.
Kỹ thuật sử dụng PCR để tổng hợp oligonucleotide ra đời từ năm 1985. Vào năm 1986 thì enzyme Taq polymerase lần đầu tiên được sử dụng. Tuy nhiên, quá trình tổng hợp oligonucleotide công nghiệp đã gặp khó khăn khi áp dụng tổng hợp oligonucleotide bằng enzym vì 3 lý do chính:
Quá trình tổng hợp enzym đòi hỏi phải có một khuôn mẫu mà tại đó thì enzym DNA polymerase mở rộng trình tự có thể hoạt động. Như vậy, quá trình tổng hợp oligonucleotide de novo bằng enzym không thể hoạt động nếu thiếu khuôn mẫu.Nhiều đoạn mồi oligo, đầu dò hoặc mục tiêu ASO có thể được sử dụng làm khuôn mẫu thì bản thân chúng lại quá ngắn để mồi và kích hoạt tổng hợp polymerase một cách hiệu quả.Nhiều oligo trị liệu nhân tạo được biến đổi về mặt hóa học để tạo điều kiện kéo dài thời gian bán rã và tăng cường chức năng trong tuần hoàn dịch thể, những biến đổi như vậy gần như hoặc hoàn toàn ngăn cản sự tương tác của chúng với các polymerase có nguồn gốc tiến hóa (hiện tượng này chủ yếu liên quan đến các loại oligo dài hơn như mRNA).Công cuộc nghiên cứu và phát triển vẫn tiếp tục để tạo ra polymerase được thiết kế có khả năng tổng hợp ASO bằng cách sử dụng nguồn nucleotide đã được biến đổi về mặt hóa học.
Bản chất phức tạp của tổng hợp oligonucleotide thường đòi hỏi mức độ quan sát quá trình cao hơn, hiểu biết về các cơ chế phản ứng và sai lệch cũng như các biện pháp kiểm soát có thể thực hiện. Việc phân tích thời gian thực với PAT có thể giảm thiểu hoặc loại bỏ nhu cầu phân tích ngoại tuyến mất thời gian hoặc chậm trễ.
Ấn Phẩm Nổi Bật: Đảm Bảo PAT Thời Gian Thực Để Tổng Hợp Dòng Oligonucleotide
Mô Hình Hóa Reactir và Chemometrics để Giảm Thiểu Rủi Ro
Rydzak, J. W., White, D. E., Airiau, C. Y., Sterbenz, J. T., York, B. D., Clancy, D. J., & Dai, Q. (2014). Đảm bảo công nghệ phân tích quy trình thời gian thực để tổng hợp dòng oligonucleotide. Nghiên cứu & phát triển quy trình hữu cơ, 19(1), 203–214.
Các tác giả lưu ý rằng mặc dù các giao thức tổng hợp oligonucleotide pha rắn tự động đã được quy định rõ ràng, nhưng yếu tố hóa học liên quan vẫn còn gây nhiều khó khăn và tốn kém. Các rủi ro chính được xác định trong sản xuất bao gồm:
Liên kết sai dung dịch hóa chất với cổng đầu vào được chỉ định của bộ tổng hợpChuẩn bị dung dịch không đúng định lượngLỗi phát sinh từ nguồn cơ học hoặc các nguồn không xác định khác liên quan đến bộ tổng hợpViệc không xác định và giải quyết bất kỳ rủi ro nào có thể dẫn đến hậu quả mất hoàn toàn quy trình. Do đó, việc sử dụng giám sát quang phổ thời gian thực cùng với mô hình hóa phân biệt, định lượng và MSPC dựa trên dữ liệu hồng ngoại trung bình đã được đưa ra để đánh giá. ReactIR được kết luận là giúp đảm bảo và kiểm soát thời gian thực cho quá trình tổng hợp và cho phép cải thiện quá trình tổng hợp tự động các chuỗi oligonucleotide. Đặc biệt, độ nhạy, chiều sâu thông tin, phạm vi rộng và khả năng tiếp cận thực nghiệm của phương pháp này được nhìn nhận là có thể sẵn sàng áp dụng để giải quyết một số lượng lớn các thách thức quan trọng trong sản xuất liên quan đến các hợp chất này, đặc biệt là xác nhận trình tự và độ tinh khiết trực tuyến.
Ấn Phẩm Nổi Bật: Nhận Dạng Phosphoramidite Trực Tiếp và Xác Nhận Trình Tự Các Chuỗi Oligonucleotide
Kiểm Soát Quy Trình Thời Gian Thực với ReactIR
McElderry, J.-D., Hill, D., Schmitt, E., Su, X., & Stolee, J. (2021). Nhận dạng phosphoramidite trực tiếp bằng FTIR để hỗ trợ xác nhận trình tự oligonucleotide thời gian thực. Nghiên cứu & phát triển quy trình hữu cơ, 25(2), 262–270.
Các tác giả lưu ý rằng trình tự Antisense Oligonucleotide (ASO) là một thuộc tính chất lượng quan trọng và phải được xác nhận như một phần của thử nghiệm nhận dạng phát hành. Tuy nhiên, việc xác nhận danh tính của sản phẩm có độ dài đầy đủ (FLP) có thể là một thách thức vì có thể có nhiều cấu trúc liên quan chặt chẽ với nhau. Các cấu trúc liên quan có thể bắt nguồn từ lỗi hóa học, sự kết hợp không mong muốn với cơ chất pha rắn, khâu chuẩn bị nguyên liệu, đo liều lượng và nhận dạng thuốc thử. Bất kỳ sự kiện nào cũng có thể dẫn đến polyme oligonucleotide có trình tự không chính xác hoặc các thuộc tính chất lượng không được chấp nhận khác.
ReactIR được sử dụng để mô hình hóa và phân biệt các phosphoramidit và dung môi trong nhận dạng và tổng hợp dòng chảy. Sự khác biệt về phổ giữa các phosphoramidite đã biến đổi cho phép xác minh quy trình thời gian thực một cách chắc chắn, nhờ đó có khả năng phát hiện lỗi trong phân phối vật liệu theo thời gian thực, trước khi gây ra lỗi trình tự. ReactIR tạo cơ hội để khắc phục sự cố mà thông thường không hề tồn tại.
Phương pháp này có thể xác định 8 loại photphoramidite khác nhau trong dung dịch axetonitril bằng cách xử lý phổ IR được thu thập theo thời gian thực. Mô hình kết quả cho thấy độ nhạy và độ đặc hiệu cao, không có phân loại sai. Mô hình này cũng thể hiện tính mạnh mẽ khi chống lại sự thay đổi tốc độ dòng chảy, sự thay đổi giữa các thiết bị, sự thay đổi của đầu dò, nồng độ dung dịch amidite và sự dịch chuyển số chu kỳ sóng.
Khả năng giám sát thời gian thực của FTIR tại chỗ và Phổ Raman đối với hóa học được thực hiện trong điều kiện dòng chảy đã được chứng minh rõ ràng và có thể áp dụng trong các bước chính của quá trình tổng hợp oligonucleotide.
Xem thêm: Top 10 Game Nhập Vai Hay Cho Ipad Năm 2020, 26 Game Nhập Vai Hay Nhất Cho Ipad
Tổng hợp các monome phosphoramidite và nucleotide tự nhiên đã biến đổi để đảm bảo cấu trúc và độ tinh khiếtGiảm thiểu rủi ro do sự cố cơ học của bộ tổng hợp hoặc nguồn cấp dung dịch không chính xác gây raTheo dõi phản ứng ghép nối của monome phosphoroamidite với nhóm hydroxyl tự do trên nucleotide liên kết pha rắnTheo dõi sự biến tính và ủ các oligonucleotide bổ sung trong tổng hợp mạch đôi.Tương quan những thay đổi trong quang phổ với những điểm chính trong quá trìnhÁp dụng cho SPS, tổng hợp peptite theo mẻ và hội tụ (Pha dung dịch SPS +)
Một môi trường tổng hợp được kiểm soát tốt là yếu tố rất quan trọng để đảm bảo kết quả phản ứng. Các nền tảng lò phản ứng tự động mang lại cả sự chắc chắn và tính nhất quán trong tất cả Thông số quy trình quan trọng.Môi trường tái sinh là nền tảng cho một nền khoa học phát triểnHiểu được tác động của các thông số quy trình đến các thuộc tính chất lượng quan trọng bằng cách kết hợp dữ liệu từ cảm biến và PAT trực tiếpGiao thức và tự động hóa giúp giảm thiểu rủi ro thủ công hoặc tính không nhất quánTạo điều kiện thuận lợi cho dữ liệu có thể tìm kiếm và có cấu trúc rõ ràngDựa trên nhiều trích dẫn và bằng chứng khoa học để mở rộng quy môÁp dụng cho SPS, tổng hợp peptite theo mẻ và hội tụ (Pha dung dịch SPS +)
Schedule a Free eDemo
Các Sản phẩm liên quan
ReactIR
In-situ FTIR spectrometers enable scientists to gain insight into their reactions and processes in a wide range of applications. Optimize reaction variables with inline FTIR instru...
ReactRaman spectrometers enable scientists to measure reaction and process trends in real time, providing highly specific information about kinetics, polymorph transitions, and mec...
Increase productivity in your lab with chemical synthesis reactors featuring built-in automation tools.
Sản phẩm & Giải pháp
